Photosyntheseversuche

1. Der Engelmann-Versuch (1882)

ENGELMANN projizierte ein durch ein Prisma aufgespaltenes Spektrum weißen Lichts auf eine Fadenalge. Im umgebenden Wasser befanden sich bewegliche, Zellatmung betreibende Bakterien. Diese waren vor der Belichtung gleichmäßig verteilt. Nach Belichtung ergab sich das gezeigte Bild der Bakterienverteilung

Erklärung: Nur rotes und blaues Licht, das von Chlorophyll absorbiert wird, ist photosynthetisch aktiv. An den Stellen, wo rot und blau eingestrahlt wird, nicht aber im grünen Bereich, findet die Photosynthese statt und es wird Sauerstoff entwickelt. Dort sammeln sich sauerstoffzeigenden Bakterien an.

2. Chromatografische Trennung der Blattfarbstoffe

Die Blattfarbstoffe werden mit einem geeigneten Lösungsmittel, Alkohol oder Aceton, aus dem zerkleinerten Blattmaterial (extrahiert) herausgelöst. Die erhaltene Lösung wird folgendermaßen chromatografiert:

Auf einen Papierstreifen oder eine beschichtete Platte wird der Extrakt mit dem Farbstoffgemisch als Fleck aufgetragen. Das Papier, das die die sogenannte stationäre Phase bildet, ist porös und saugt die Flüssigkeit auf.

Der Papierstreifen wird in eine Chromatografiekammer gebracht und in ein Lösungsmittel getaucht, das auch Laufmittel oder mobile Phase heißt, weil es nach oben wandert und die Farbstoffe transportiert. Da die verschiedenen Farbstoffe unterschiedlich stark an der Papieroberfläche haften, werden sie unterschiedlich zurückgehalten ("gebremst") und somit aufgrund ihrer verschiedenen Wanderungsgeschwindigkeit getrennt.

Im Ergebnis sieht man, dass im Blatt neben den Chlorophyllen auch andere Farbstofftypen enthalten sind: Carotine und Xanthophylle. Diese gelben Farbstoffe heißen auch Hilfspigmente, da sie die Lichtabsorption von Chlorophyll unterstützen.

Sollen Gemische, die aus einer großen Anzahl von Reinstoffkomponenten bestehen, sauber aufgetrennt werden, reicht der Trenneffekt der einfachen Chromatografie nicht aus. Man macht dann eine 2-dimensionale Chromatografie; das sind zwei hintereinander durchgeführte Chromatografien:

– 1. Chromatografie mit dem ersten Laufmittel auf einer rechteckigen Platte

– Platte um 90° drehen

– 2. Chromatografie mit einem anderen Laufmittel, wobei die Stoffe senkrecht zu der Richtung der ersten Chromatografie laufen.

Dieses Verfahren wendete Calvin zusammen mit der Autoradiografie an.

3. Calvin-Experiment, Autoradiografie und Tracerexperimente

Calvin-Experiment zur Aufklärung lichtunabhängigen Reaktion

Die Algen betreiben zunächst Stoffwechsel mit "normalem" CO₂ (in der Abb. oben). Diese Algen fließen durch einen transparenten PVC-Schlauch nach unten ab und ihnen wird an einer bestimmten Stelle und damit ab einem bestimmten Zeitpunkt radioaktives ¹⁴CO₂ über die Einspritzung zugeführt. Auf der Strecke bzw. im Zeitraum von der Einspritzung bis zur Abtötung im siedenden Alkoholbad betreiben die Algen ihren Stoffwechsel mit dem ¹⁴CO₂, welches radioaktiven Kohlenstoff, das Isotop ¹⁴C enthält. Dieser Kohlenstoff baut sich in die organischen Stoffe ein, die im Verlauf der lichtunabhängigen Reaktion gebildet werden. Mit der nachfolgenden Autoradiografie konnte Calvin die unterschiedlichen Verbindungen auftrennen und identifizieren.

Autoradiografie

Autoradiographie bezeichnet die Sichtbarmachung eines chemischen Stoffes anhand enthaltener radioaktiver Isotope, ursprünglich durch Schwärzung eines fotografischen Filmes. Auto- betont dabei, dass der sichbarzumachende Stoff selbst die radioaktive Strahlung abgibt. Calvin kombinierte die Autoradiografie mit einer 2-dimensionalen Chromatografie.

Die Autoradiagramme bauen auf dem Calvin-Experiment auf:

¹⁴CO₂-Gabe zum Zeitpunkt t=0; Stoffwechselabbruch nach 5 s bzw. nach 60 s. Nach 5 s findet sich das Radioisotop ¹⁴C noch ausschließlich in der 3-Phosphoglycerinsäure, die durch die Fixierung des ¹⁴CO₂ gebildet wird. Nach 60 s strahlen alle organischen Stoffe, die im Calvin-Zyklus vorkommen, ca. 20 verschiedene C3-, C4-, C5-, C6- und C7-Körper. Jeder Stoff verursacht einen Schwärzungsfleck auf der fotografisch entwickelten Chromatografie-Platte. (Originale nach Calvin)

in etwas anderer Darstellung, stärker schematisiert, nach 5 s, 10 s und 30 s

3. Tracer-Experimente

Ein Tracer (engl. trace = Spur) ist eine meist radioaktiv markierte Substanz. Dieser Stoff nimmt nach Einbringung des Stoffes in den lebenden Körper am Stoffwechsel teil und die radioaktive Markierung lässt Weg der Substanz im Stoffwechsel nachverfolgen. Natürlich steht die Tracer-Methode der Autoradiografie sehr nahe. Durch den Einsatz des Radioisotops ¹⁸O ließ sich zeigen, dass der Photosynthese-O₂ ausschließlich bei der Photolyse von H₂O entsteht und nicht aus dem CO₂ stammt. Die Ergebnisse dieses Tracer-Experimentes führten zur Aufstellung der verbesserten Summengleichung der Photosynthese

6 CO₂ + 12 H₂O C₆H₁₂O₆ + 6 O₂ + 6 H₂O O steht für ¹⁸O

6 CO₂ + 12 H₂O C₆H₁₂O₆ + 6 O₂ + 6 H₂O verbesserte Summengleichung

eine alte Fehlvorstellung, die auch den Namen Kohlenhydrat prägte, nämlich dass Wasser sich an den Kohlenstoff im CO₂ anlagert und dort den Sauerstoff verdrängt, "CO₂ + H₂O CH₂O + O₂" konnte damit entgültig widerlegt werden.